本測試盒用直接競爭免疫分析法定量測定河豚魚中的河豚毒素（TTX）。該測試盒反應(yīng)孔可拆卸，可測單份樣品，也可測多份樣品。定量分析時需有含450nm波長的微孔板酶標(biāo)儀。

1 概要

河豚魚是近海底棲居的肉食性有毒海產(chǎn)魚類，其內(nèi)臟有毒。其毒性物質(zhì)主要是河豚毒素，河豚毒素是一種劇烈的神經(jīng)毒素，其性質(zhì)穩(wěn)定，加熱、鹽腌及高溫烹煮均不能使其破壞，其毒性比晴化鈉大1000倍。因誤食或食用加工不當(dāng)?shù)暮与圄~而發(fā)生人畜中毒的事件每年都有發(fā)生。故準(zhǔn)確檢測河豚魚中的河豚毒素對預(yù)防和控制河豚毒素中毒，具有重要意義。本檢測方法具有靈敏、快速、簡便、特異性好、取樣量小、不破壞魚體結(jié)構(gòu)，并可同時檢測大量樣品等優(yōu)點。

2 測定原理

本測試盒利用固相酶聯(lián)免疫吸附原理，采用直接競爭ELISA法進行測定。用抗原包被微孔板，加入河豚毒素標(biāo)準(zhǔn)品或樣品、抗河豚毒素酶標(biāo)單克隆抗體進行免疫反應(yīng)后，加入底物顯色，終止液終止后，用酶標(biāo)儀在450nm處測定OD值。

3 提供的物品

微孔板

5個濃度的TTX標(biāo)準(zhǔn)溶液（各1mL）

標(biāo)準(zhǔn)1：0ng/mL    …………………………………………………………直接使用

標(biāo)準(zhǔn)2：5.0ng/mL ……………………………………………………………直接使用

標(biāo)準(zhǔn)3：20.0ng/mL       …………………………………………………直接使用

標(biāo)準(zhǔn)4：50.0ng/mL       …………………………………………………直接使用

標(biāo)準(zhǔn)5：200.0ng/mL     …………………………………………………直接使用

抗TTX抗體溶液（6mL）       …………………………………………………直接使用

顯色液（12mL）       ……………………………………………………………直接使用

終止液（6mL） ………………………………………………………………………直接使用

濃縮洗液（30mL）   …………………………………………………………………稀釋使用

4 盒中未提供，需自備物品

微孔板酶標(biāo)儀（含450nm）、振蕩器、粉碎機、微量移液器

量筒、漏斗、容量瓶、快速定性濾紙

乙酸、甲醇（分析純）、去離子水或蒸餾水

5 操作者注意事項

    標(biāo)準(zhǔn)溶液中含有TTX毒素，應(yīng)特別小心。

終止液為1N硫酸，避免接觸皮膚。

每次加樣后立即將所有試劑放回2~8 ℃。

每步加樣時間應(yīng)控制在5min內(nèi)。

孵育過程中應(yīng)避光。

不要使用過期試劑盒。

    不要交叉使用不同批號的試劑盒中的試劑。

6 儲存條件

     保存試劑盒于2~8℃。不要冷凍

     顯色液對光敏感，因此要避免直接暴露在光線下。

     將不用的微孔板放進原鋁箔袋中，置2~8℃保存。

7 試劑變質(zhì)的標(biāo)志

      標(biāo)準(zhǔn)1的吸光度值小于0.5個單位（A_450nm<0.5）時，表示試劑可能變質(zhì)。

8 樣品處理

----樣品應(yīng)當(dāng)保存在陰涼避光之處及冷藏保存；

----稱取5g河豚魚樣品（肌肉、皮或內(nèi)臟），剪碎，組織勻漿器打碎，加入25mL 0.1%的乙酸，在電爐上煮沸攪拌10min。

----待冷卻至室溫后，3000rpm離心10min。

----上清用快速定性濾紙過濾于125mL分液漏斗中。

----沉淀加入20mL0.1% 乙酸，再煮沸3min，重復(fù)步驟3~4。

----加入等體積乙迷脫脂，靜置分層，放出水層至另一分液漏斗中，再重復(fù)脫脂1次。

----將水層放入50mL量筒中，用0.1%乙酸定容至40mL，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

----測定時取1mL提取液，用1mol/L氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH至6.5-7.0，立即用于檢測。

9 酶免疫分析程序

----濃縮洗液為10倍濃縮液，使用時與去離子水或蒸餾水按體積比1:9稀釋后使用。

    ----取所需數(shù)量的板條插入微孔架，記錄樣品及標(biāo)準(zhǔn)的位置。

    ----加入50mL標(biāo)準(zhǔn)品或處理好的樣品到微孔，每個標(biāo)準(zhǔn)和樣品必須使用新的吸頭。

----加入50mL抗TTX抗體溶液到每個微孔（注意移液器管尖不要接觸到孔中的液體，避免交叉污染）中，37℃孵育90min。

----甩掉孔中液體，用洗液洗滌微孔板3min×3次，zui后一次應(yīng)在吸水紙上拍打以*除去孔中液體。

    ----每孔加入顯色液100mL（2滴），37℃孵育10min。

    ----每孔加入終止液50mL（1滴），立即用酶標(biāo)儀在波長450nm處測定吸光度值（OD值）。

10 樣品濃度計算

以標(biāo)準(zhǔn)溶液OD值與標(biāo)準(zhǔn)1OD值的比值為縱坐標(biāo)，所對應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度（ng/mL）的對數(shù)值為橫坐標(biāo)，制作校正曲線。根據(jù)樣品OD值與標(biāo)準(zhǔn)1OD的比值，可從曲線上得到對應(yīng)點的橫坐標(biāo)，即為TTX濃度的對數(shù)值，求得反對數(shù)即為測定液中TTX濃度C（ng/mL），按下列公式計算出樣品中TTX含量：

TTX含量（mg/kg）= C×K

式中：C：稀釋后樣品提取液中TTX含量（ng/mL）

            K：樣品稀釋倍數(shù)（本提取方法為8）

11 主要技術(shù)指標(biāo)及參數(shù)

11.1 zui低檢出濃度5.0 ng/mL。

11.2 加標(biāo)回收率在70-120%，條內(nèi)變異系數(shù)＜10%，條件變異系數(shù)＜15%。

11.3 線性范圍：5.0~200.0ng/ml。

附圖（僅供參考）

                  TTX濃度（ng/mL）對數(shù)值

                              TTX校正曲線

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