儲存和使用期：2-8°C

應(yīng)用：用于定性檢測人血清，血漿，細(xì)胞培養(yǎng)上清液或任何生物液體中的YFV-IgM。

介紹

黃熱病，稱為黃色杰克，黃色瘟疫或青銅約翰，是一種急性病毒性疾病。在大多數(shù)情況下，癥狀包括發(fā)熱，寒戰(zhàn)，食欲不振，特別是在背部的肌肉痛，和頭痛。癥狀通常在五天內(nèi)改善。在一些人在一天內(nèi)改善，發(fā)燒回來，腹痛發(fā)生，肝損傷開始導(dǎo)致黃色皮膚。如果發(fā)生這種情況，出血和腎臟問題的風(fēng)險也增加。

測定原理

96孔板YFV-IgM特異性抗原。將對照或測試樣品加入到合適的孔中并孵育。用洗滌緩沖液洗去游離組分。將HRP綴合的檢測試劑加入到孔中。 TMB底物用于顯現(xiàn)HRP酶反應(yīng)。 TMB由HRP催化以產(chǎn)生在加入酸性停止溶液后變?yōu)辄S色的藍(lán)色產(chǎn)物。黃色的密度與板中捕獲的樣品的YFV-IgM量成比例。外徑在微板讀數(shù)器中在450nm下通過分光亮度計測量吸亮度，然后可以計算YFV-IgM的濃度。

套件組件

1.       一個96孔板預(yù)涂

2.       陽性對照：0.5ml

3.       陰性對照：0.5ml

4.       洗滌緩沖液（30×）：20 ml。稀釋：1:30

5.       樣品稀釋緩沖液：6ml

6.       6HRP酶聯(lián)試劑（RTU）：6ml

7.       終止液：6ml

8.       TMB底物：6ml

9.       TMB底物B：6ml

10.   板密封：2

11.   密封袋：1

需要材料但不提供

1.37℃培養(yǎng)箱

2.酶標(biāo)儀（波長：450nm）

3.精確的移液器和一次性移液器吸頭

4.自動洗板機

5.ELISA振蕩器

1.5ml管

7.板蓋

8.吸收濾紙

9.100ml和1L體積量筒。

使用程序:

A.制備樣品和試劑

1. 樣品

收集并立即分析測試樣品（2小時內(nèi)）后立即分離。或等分并長期儲存在-20°C。避免多個凍融循環(huán)。

?細(xì)胞培養(yǎng)上清：以約2000-3000×rpm離心20分鐘，以去除沉淀，立即分析或分裝，并儲存于-20℃。

?血清：在室溫下凝結(jié)血清（約4小時）。以約2000-3000×rpm離心20分鐘。立即分析血清或等分，并儲存在-20°C。

?血漿：用檸檬酸鹽或EDTA作為抗凝劑收集血漿。在收集30分鐘內(nèi)以2000-3000×rpm離心20分鐘。立即分析或等分，并存儲在-20°C冷凍。

尿：在無菌容器中收集，以2000-3000×rpm離心20分鐘。立即分析或等分，并存儲在-20°C冷凍。

組織：組織勻漿的制備將根據(jù)組織類型而變化。收集和沖洗樣品在2-4℃下用PBS（Ph 7.4）。稱重樣品并用PBS（Ph 7.4）勻化，并對細(xì)胞懸浮液進(jìn)行超聲處理。以2000-3000×rpm離心20分鐘。立即測定或等分并儲存在-80℃。

注意：

1.凝結(jié)血液樣品，離心，避免溶血和沈淀。

2.NaN3不能用作試驗樣品防腐劑，因為它抑制HRP。

2.洗滌緩沖液

用蒸餾水稀釋濃縮洗滌緩沖液30倍（1/30）（即將20ml濃縮洗滌緩沖液加入580ml蒸餾水中）。

B.測定程序

在使用前將試劑盒組分和樣品平衡至室溫。建議繪制每個測試的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.在預(yù)涂板上分別設(shè)置陽性/陰性，測試樣品和對照（零）孔，并記錄它們的位置。

2.將50μl的陰性和陽性對照等分到設(shè)定的孔中。

3.向?qū)φ眨悖┛字屑尤?0μl樣品稀釋緩沖液。

4.向測試樣品孔中加入50μl適當(dāng)稀釋的樣品。在底部加入溶液而不接觸側(cè)壁。搖動平板以混合內(nèi)容物。

5.用蓋子密封板，并在37℃孵育30分鐘。

6.取下蓋子并通過在吸收性濾紙或其他吸收材料上敲擊板來丟棄板內(nèi)容物。

7.棄去溶液，用洗滌緩沖液洗滌板5次。不要讓孔在任何時候干燥。

手動清洗：丟棄溶液，不要接觸側(cè)壁。將吸水濾紙或其他吸收材料上拍出液體。將洗滌緩沖液填滿每個孔，并在ELISA振蕩器上輕輕渦流2 分鐘。丟棄內(nèi)容物，并將吸收性濾紙或其他吸收材料上的板敲打。洗板五次。

自動洗滌：棄去所有孔中的溶液，并用洗滌緩沖液洗滌板5次（用緩沖液過量填滿孔）。在最后的洗滌之后，翻轉(zhuǎn)該板并敲擊吸收性濾紙或其它吸收材料。建議將清洗器設(shè)置為1分鐘的浸泡時間。

8.向每個孔中加入50μlHRP結(jié)合物的試劑（對照孔除外）。在每個孔底部加入溶液，不要接觸側(cè)壁。

9.用蓋子密封板，并在37℃孵育30分鐘。

10.取下蓋子，用洗滌緩沖液洗板5次。

11.向每個孔中加入50μlTMB底物A和50μlTMB底物B，蓋上平板并在37℃下孵育15分鐘。避免暴露于光。

12.向每個孔中加入50μl終止液，充分混勻。顏色應(yīng)立即變?yōu)辄S色。

13.閱讀O.D.在微板讀數(shù)器中在450nm的吸亮度在加入終止溶液的15分鐘內(nèi)。對于計算，（相對O.D.450）=（每個孔的O.D.450） - （零阱的O.D.450）。標(biāo)準(zhǔn)曲線可以作為每種標(biāo)準(zhǔn)溶液（Y）的相對O.D.450與標(biāo)準(zhǔn)溶液（X）的相應(yīng)濃度作圖?？梢詮臉?biāo)準(zhǔn)曲線插入樣品的人類YFV-IgM濃度。

14.注意：如果稀釋樣品，稀釋倍數(shù)乘以內(nèi)插法得到稀釋前的濃度。

C.結(jié)果確定

1.試驗有效性：陽性對照的平均值≥1.00; 陰性對照的平均值≤0.10。

2.臨界值（CUT OFF）計算：臨界值=負(fù)控制的平均值+0.15

3.陰性結(jié)果：如果OD值<CUT OFF，樣品為人YFV-IgM陰性。

4.陽性結(jié)果：如果OD值≥CUTOFF，樣品為人類YFV-IgM陽性。

D.注意事項

1.在實驗之前，離心每個試劑盒組分?jǐn)?shù)分鐘，將所有試劑倒入試管底部。

2.在混合或重新組裝部件時避免起泡或氣泡。

3.洗滌緩沖液可結(jié)晶并分離。如果發(fā)生這種情況，請加熱管以溶解。

4.建議每個對照和樣品一式兩份或重復(fù)測量三次。

5.不要讓板在任何時候干燥！這可以使板上的生物材料失活。

6.不要重復(fù)使用移液器吸頭和管，以避免交叉污染。

7.不要使用不同套件中過期的組件或組件。

8.將TMB底物B儲存在黑暗中，并且為了避免板溫育對于溫度差的邊緣效應(yīng)，建議在使用前在室溫下使TMB底物平衡30分鐘。用滅菌的吸頭抽吸所需的劑量，不要將殘留溶液倒回到小瓶中。